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點(diǎn)成分享 | 蛋白質(zhì)濃度測定之考馬斯亮藍(lán)(Bradford)法

虹科生命科學(xué)儀器 ? 來源:虹科生命科學(xué)儀器 ? 作者:虹科生命科學(xué)儀器 ? 2022-11-22 10:02 ? 次閱讀

蛋白質(zhì)是組成生物細(xì)胞、組織的重要成分,生物的所有生命活動(dòng)都離不開蛋白質(zhì)的參與。蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ),是構(gòu)成細(xì)胞的基本有機(jī)物,是生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者。生物材料中蛋白質(zhì)含量的測定是生物學(xué)研究中最重要也是最基本的實(shí)驗(yàn)操作之一,目前常見的測定方法有考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法)、紫外吸收法、雙縮脲法(Biuret法)、Folin-酚試劑法(Lorry法)、二喹啉甲酸法(BCA法)和凱式定氮法(Kjedahl法)等。每種方法原理不同,操作不同,都有其優(yōu)點(diǎn)和局限性。

本文介紹的是考馬斯亮藍(lán)法,即Bradford法測定蛋白質(zhì)的相關(guān)內(nèi)容,它是通過染色方法測定溶液中蛋白質(zhì)濃度的方法,是目前迅速可靠且靈敏度最高的蛋白質(zhì)測定方法之一。

實(shí)驗(yàn)原理:

Bradford蛋白質(zhì)測定法是根據(jù)蛋白質(zhì)與染料結(jié)合的原理設(shè)計(jì)的。考馬斯亮藍(lán)染料(G-250)在酸性溶液中與蛋白質(zhì)的堿性氨基酸和芳香族氨基酸殘基結(jié)合,使得染料的最大光吸收峰位置由原來的465nm變?yōu)?95nm,溶液顏色也由原來的棕紅色變?yōu)樗{(lán)色,反應(yīng)迅速且穩(wěn)定,形成的化合物顏色深淺在一定范圍內(nèi)與蛋白質(zhì)濃度成正比關(guān)系,因此可通過測定結(jié)合染色后溶液在595nm處的光吸收度值來計(jì)算溶液中蛋白質(zhì)的含量。

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通過分光光度計(jì)先測定已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液染色后在波長595nm的吸光度A595并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,然后測定同樣染色后的待測蛋白溶液在波長595nm的吸光度值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線即可計(jì)算出待測蛋白質(zhì)的濃度。

實(shí)驗(yàn)器材:

分光光度計(jì)(例如點(diǎn)成DEN-600小型光度計(jì))

渦旋混勻器

試管及試管架

塑料/玻璃比色皿

微量移液器

主要溶液/試劑:

標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液:可用牛血清白蛋白(BSA)作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。配制成1.0mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液,4℃存放。

考馬斯亮藍(lán)G250染料試劑:稱取100 mg考馬斯亮藍(lán)G250,溶于50mL的95%乙醇后加入120mL 85%的磷酸,最后加入去離子水將試劑稀釋到1L。

待測蛋白溶液

實(shí)驗(yàn)操作:

制取不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液:可取普通潔凈的試管7支,1號(hào)管取放0.1mL去離子水作為空白組,2-6號(hào)用微量移液器分別加入1.0mg/mL的BSA溶液0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mL,然后每管均用去離子水補(bǔ)充到0.1mL,另外7號(hào)試管取放待測蛋白溶液0.1mL,所有試管用渦旋混勻器充分混勻;

加入染色試劑:用移液器或者移液管向上述試管分別加入3.0mL考馬斯亮藍(lán)G250試劑,用渦旋混勻器輕輕快速混合均勻;

比色:考馬斯亮藍(lán)試劑與蛋白質(zhì)結(jié)合速度快,2-5分鐘即可完成,1小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定,故可以在溶液靜置5分鐘后在分光光度計(jì)上測定各試管溶液在波長595nm處的光吸收值A(chǔ)595;

比色時(shí)使用的比色皿最好選用玻璃或者塑料比色皿,不要使用石英或者硅膠比色皿,因?yàn)榭捡R斯亮藍(lán)染料容易結(jié)合附著于石英或硅膠材料上,不易洗去染色。

比色完成后及時(shí)用水清洗,再用40%乙醇潤洗,洗去顏色,最后再用水洗凈。

如果使用的是塑料比色皿,乙醇潤洗時(shí)間不宜過長,決不能在乙醇或者丙酮中長時(shí)間浸泡,因?yàn)槟菚?huì)導(dǎo)致塑料比色皿溶脹失真。

制作標(biāo)準(zhǔn)曲線:以標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo),吸光度值A(chǔ)595為縱坐標(biāo)作圖,可進(jìn)行直線擬合,即可得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線;

計(jì)算待測蛋白質(zhì)濃度:將分光光度計(jì)測出的待測蛋白質(zhì)溶液的光吸收度A595值,對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線即可算出待測蛋白質(zhì)濃度。

點(diǎn)成DEN-600光度計(jì), 是一款緊湊、便攜、可電池供電的光度計(jì),可以方便地放置在生物安全柜、培養(yǎng)箱中,該設(shè)備可容納10mm光程的標(biāo)準(zhǔn)比色皿、普通圓底試管或離心管等。USB連接和DEN軟件可進(jìn)行數(shù)據(jù)傳輸、數(shù)據(jù)處理和計(jì)算。600 nm波長光學(xué)系統(tǒng)設(shè)計(jì)可以進(jìn)行如下測量:估算細(xì)胞總數(shù)(OD600)、濁度測量(McFarland單位)、蛋白質(zhì)濃度測量(Bradford 蛋白質(zhì)測定法)。分光光度計(jì)通常應(yīng)用于這些領(lǐng)域,因此DEN-600可作為分光光度計(jì)的平價(jià)替代品。

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審核編輯 黃昊宇

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