1 液體活檢背景介紹

近年來，腫瘤診療技術(shù)已取得很大進(jìn)步，但是癌癥依然是導(dǎo)致人類死亡的主要因素。癌癥轉(zhuǎn)移是造成癌癥患者死亡的重要因素，同時(shí)轉(zhuǎn)移過程相對復(fù)雜，增加了癌癥診療的困難。因此，對于癌癥，做到早期診斷、實(shí)時(shí)監(jiān)測和準(zhǔn)確預(yù)后是非常關(guān)鍵的。

目前，傳統(tǒng)的組織活檢方式存在很多問題，如：成本高、取樣難、創(chuàng)傷大等，且難以做到“早篩查、早治療”。隨著生物技術(shù)、分子技術(shù)和納米技術(shù)的發(fā)展，一系列新型技術(shù)被應(yīng)用到癌癥的診療中。液體活檢作為體外診斷的前沿領(lǐng)域，涵蓋非侵入式取樣，檢測腫瘤或轉(zhuǎn)移灶釋放到血液中的循環(huán)腫瘤生物標(biāo)志物(CTCs、Exosomes和cNAs)，為監(jiān)測腫瘤動(dòng)態(tài)及個(gè)體化治療提供新的方式，受到人們的關(guān)注(圖1)。

圖1：癌癥的形成(A)、轉(zhuǎn)移(B)及循環(huán)腫瘤標(biāo)志物的特點(diǎn)(C)

2 微流控技術(shù)的應(yīng)用分析液體活檢背景介紹

1 微流控技術(shù)概述

微流控技術(shù)是一種在微米尺寸級(jí)別下處理或操縱液體的技術(shù)手段，將混合器、執(zhí)行器、反應(yīng)器、分離器、傳感器等集于一體，從而優(yōu)化檢測過程。其涉及到電子、機(jī)械、化學(xué)、物理和生物等多門學(xué)科，具有通量高、靈敏度高、樣本分析時(shí)間短、樣本量少、可控性強(qiáng)等優(yōu)勢，被廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代分析化學(xué)、藥劑學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)等諸多研究領(lǐng)域。也正是基于以上多種優(yōu)勢，微流控技術(shù)為探索液體活檢中的循環(huán)腫瘤生物標(biāo)志物檢測打開通道，為癌癥的早期診斷與治療提供新的有效手段。

2 應(yīng)用分類介紹

1) 循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)檢測

循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)是指從原發(fā)腫瘤或者轉(zhuǎn)移灶的邊緣脫落進(jìn)入癌癥患者外周血循環(huán)的腫瘤細(xì)胞，其不僅攜帶了腫瘤細(xì)胞的全部基因組并且在癌癥病變早期就已經(jīng)存在于外周血循環(huán)中，因此CTCs被作為癌癥研究的重要對象和癌癥早期診斷、療效評估的重要標(biāo)志物，可實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)非侵入式的監(jiān)控癌癥的發(fā)展變化及治療效果。

近年來，CTCs的分離與純化技術(shù)不斷發(fā)展，但由于CTCs的腫瘤異質(zhì)性及稀有性(每107-109個(gè)血液細(xì)胞中僅有1-10個(gè)CTCs)，分離與純化CTCs面臨巨大挑戰(zhàn)。微流控技術(shù)平臺(tái)因其集成度高、設(shè)計(jì)靈活、材料通用性強(qiáng)和自動(dòng)化程度高，被廣泛應(yīng)用于CTCs的分離純化中。

目前，基于微流控技術(shù)分離CTCs的方法大致分為兩大類：無標(biāo)簽技術(shù)和免疫親和技術(shù)(圖2)。前者是建立在物理性質(zhì)基礎(chǔ)上分離目標(biāo)細(xì)胞，如大小，密度，形狀，變形性和介電性能，而后者主要利用靶細(xì)胞的生化特性，通過細(xì)胞表面特異性表達(dá)的蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物(主要分為anti-EpCAM正向捕獲法與anti-CD45負(fù)向富集法)分離靶細(xì)胞(圖2)。

圖2：微流控系統(tǒng)分離CTCs的方法

基于免疫磁珠分離富集CTCs是最常用的方法，具有高靈敏度和高特異性。美晶醫(yī)療自主研發(fā)的基于微流控技術(shù)的CTCs檢測平臺(tái)CellRichTM，可以通過癌細(xì)胞表面抗原和共軛偶聯(lián)到磁珠上的抗體間的相互作用，高效富集CTCs。當(dāng)血液流經(jīng)該微流體裝置時(shí)，其他血細(xì)胞在流體力學(xué)的作用下被分離出去，與免疫磁珠結(jié)合的細(xì)胞會(huì)在磁場的作用下發(fā)生偏轉(zhuǎn)進(jìn)入分離富集通道，以此達(dá)到對循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離捕獲的目的。此法與傳統(tǒng)的物理分離方法相比，具有較高的回收率與純化度(圖3)。

圖3：基于免疫磁珠分離CTCs的微流控系統(tǒng)

2) 外泌體檢測

循環(huán)腫瘤外泌體是指由腫瘤細(xì)胞分泌的具有生物活性的囊泡小體，直徑為20-300nm。不同來源的外泌體含有其獨(dú)特的脂質(zhì)、RNA、DNA和蛋白質(zhì)等，可直接反映細(xì)胞的來源及進(jìn)展。外泌體廣泛存在于人體體液中，具有很高的豐度(每毫升血液中含有109-1012個(gè)外泌體)。因此對腫瘤來源外泌體的檢測和分析可以作為無創(chuàng)探究腫瘤來源與進(jìn)展，進(jìn)而輔助腫瘤的早期診斷和指導(dǎo)腫瘤治療。

近年來，外泌體作為腫瘤生物標(biāo)志物成為無創(chuàng)活檢(液體活檢)的研究熱點(diǎn)，但外泌體分泌是一種動(dòng)態(tài)的過程，其在體液中實(shí)時(shí)變化，且在腫瘤治療過程中也存在穩(wěn)定性問題。因此，精確分離和分析外泌體仍然面臨巨大挑戰(zhàn)性。與傳統(tǒng)的外泌體分離技術(shù)如超速離心法，密度梯度離心法等相比，微流控技術(shù)在檢測自動(dòng)化、集成能力、消耗時(shí)間、產(chǎn)物完整性、純度、回收率等方面具有很大優(yōu)勢，進(jìn)而有利于外泌體的下游分析應(yīng)用。

目前，基于微流控技術(shù)分離純化外泌體的方法主要分為兩大類：囊泡大小(20-300nm)和表面生物標(biāo)志物(如EpCAM、CD9、CD63、CD81)，且各有特點(diǎn)。前者建立在納米多孔結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)快速高效捕獲外泌體，但因外泌體的尺寸范圍在納米級(jí)別，因此對技術(shù)要求較高，且可能受到飽和限制;后者利用免疫親和原理，建立的微流控系統(tǒng)有抗體修飾微通道或免疫磁珠法(圖4)，具有高通量、高靈敏度，然而外泌體也具有與CTCs類似的異質(zhì)性，對于特定生物標(biāo)志物低表達(dá)的外泌體捕獲效率不高。

圖4：基于免疫親和原理分析外泌體的微流控系統(tǒng)

另外，對于外泌體的研究雖發(fā)展迅速，但與CTCs相比，市場上缺乏成熟的微流控檢測系統(tǒng)，在液體活檢領(lǐng)域，外泌體的研究應(yīng)用沒有CTCs廣泛和成熟。因此，為了更精準(zhǔn)的定量和定性分析腫瘤來源外泌體，深入探究外泌體的物理與生物特性，設(shè)計(jì)結(jié)合多個(gè)功能于一體的新型微流控系統(tǒng)，對于分離分析外泌體是至關(guān)重要的。

3) cNAs檢測

循環(huán)核酸(cNAs)是指血液循環(huán)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的DNA和RNA片段?？梢酝ㄟ^非侵入性手段獲取cNAs，用于分析腫瘤的遺傳信息及表觀遺傳信息。基因表達(dá)譜與腫瘤的發(fā)展及進(jìn)展顯著相關(guān)。因此，cNAs作為液體活檢重要的生物標(biāo)志物，可用于癌癥的早期診斷和療效評估。

鑒于現(xiàn)在檢測技術(shù)不成熟，限制了腫瘤標(biāo)志物cNAs的臨床應(yīng)用。傳統(tǒng)提取分析核酸的方法，如電泳結(jié)合熒光染色技術(shù)，有一定的局限性，勞動(dòng)密集型和高成本，且分步操作容易導(dǎo)致樣品損失。微流控系統(tǒng)集多種技術(shù)于一體，一個(gè)設(shè)備可順序執(zhí)行多個(gè)操作，如樣品制備，反應(yīng)，分離，純化和分析，減少樣本損失，提高樣本純度。

因此，新型微流控系統(tǒng)可作為科研人員研究循環(huán)生物標(biāo)志物的重要手段，亦是檢測腫瘤生物標(biāo)志物的未來發(fā)展方向。但是，目前用于cNAs檢測的微流控系統(tǒng)，依然存在待解決的難題：a)常規(guī)提取核酸的過程是分步完成的，不能保證核酸片段的完整性，易導(dǎo)致分析錯(cuò)誤，需要開發(fā)柔和、簡便、快捷的提取核酸方法，從而充分發(fā)揮基因圖譜分析及分子測序技術(shù)的強(qiáng)大功能。b)傳統(tǒng)的微流控系統(tǒng)只是單純的分離系統(tǒng)， cNAs分析，需借助qPCR，數(shù)字PCR和測序平臺(tái)等，而PCR方法有其內(nèi)在的限制，如擴(kuò)增錯(cuò)誤，重復(fù)性差和擴(kuò)增效率不同。

圖5：分析cNAs的微流控系統(tǒng)

另外，遺傳突變在不同腫瘤中的概況遠(yuǎn)比我們所能想象的要復(fù)雜，存在嚴(yán)重的腫瘤異質(zhì)性，使得通過解析cNAs輔助癌癥診療更加艱難。這要求優(yōu)化現(xiàn)有微流控系統(tǒng)性能，結(jié)合基因特性，開發(fā)更多高精準(zhǔn)、高效率、高集成度的微流控系統(tǒng)，從而更好地服務(wù)于液體活檢的臨床應(yīng)用。

3 結(jié)語

液體活檢作為一種新型的非侵入性的樣本獲取方法，為癌癥診斷與治療提供新的方式。微流控技術(shù)因其具有高度集成化及時(shí)空操控性強(qiáng)等優(yōu)勢，為液體活檢提供重要平臺(tái)，并吸引了科學(xué)界和生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)界的極大關(guān)注。

與此同時(shí)，在臨床腫瘤診療的轉(zhuǎn)化應(yīng)用上，腫瘤液體活檢依然面臨重重挑戰(zhàn)：

a)這三種腫瘤生物標(biāo)志物的含量及其稀少，且存在腫瘤異質(zhì)性，使得對其分離和純化非常困難?？朔@一挑戰(zhàn)，需要開發(fā)充分利用腫瘤生物標(biāo)志物的物理學(xué)與生物學(xué)特性相結(jié)合的微流控平臺(tái)。

b)高精準(zhǔn)度、全自動(dòng)化的基于微流控分離、純化腫瘤生物標(biāo)志物的系統(tǒng)多處于科研階段，未被臨床廣泛應(yīng)用。

c)循環(huán)腫瘤生物標(biāo)志物與微流控平臺(tái)之前的關(guān)系尚需完善，為進(jìn)一步推動(dòng)靈敏度高、重復(fù)性好的微流控系統(tǒng)的開發(fā)，需在多種癌癥患者中進(jìn)行大量的臨床試驗(yàn)。

d)我們對腫瘤生物學(xué)的理解仍處于起步階段。隨著不斷深入研究各種循環(huán)腫瘤生物標(biāo)志物在腫瘤形成和發(fā)展中的作用，更強(qiáng)大、更有效的商業(yè)化微流控系統(tǒng)將應(yīng)運(yùn)而生。